EGFR突变的ddPCR血液检测
基于对EGFR基因突变在肿瘤发病机理中的深刻理解，使得过去40年间对非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗取得了长足的进步。然而在接受EGFR-TKI治疗的9~12个月后，约50%的患者会出现获得性耐药。临床上对这部分患者在分子层面进行耐药的监控存在下列主要困难：
re-biopsies是侵入式的，具有创伤性
由于肿瘤的异质性，即使获得组织样品未必能完整地反映肿瘤病灶的整体变化，尤其在患者出现PD之后
在治疗的整个过程中，re-biopsies几乎不能满足动态监控的要求
这种情况下，诸如血液、痰液和胸膜液等易连续获得的样品成为进行动态分子检测的对象。本医院和阿斯利康完成的联合研究：采用微滴式数字PCR（ddPCR）和NGS两种方法对晚期NSCLC患者血浆ctDNA中的EGFR突变进行动态的定量分析。一来评估ctDNA中EGFR突变含量与患者预后之间的关系；二来评估两种方法分析结果的一致性。
入组患者与血液样本的收集
入组患者说明：共73名NSCLC患者，组织样品的检测均为EGFR突变阳性。其中41名为19Dels，30名为LR，另外2名为19Dels和LR突变。
其中37（51%）名患者并接受TKI一线治疗，其余患者接受TKI二线治疗及更后期治疗。
预后情况随访至年10月，中位随访时间为23.8个月。截至最后一次随访，其中67名患者出现PD，38名患者死亡，死亡率为52.1%。入组患者的临床特征描述见下表。
67名出现PD的患者，均取得“成对”的血液样品（TKI治疗前及PD后），PD后和采集血样之间的间隔最长不超过4周，其间不接受化疗。其余6名患者没有疾病进展。
患者EGFR突变组织检测与ddPCR血液检测的一致性
73名患者的血浆ctDNA经ddPCR检测，其中54名患者含有EGFR敏感突变，血液检测与组织检测的一致性为74%。（31名患者为19Dels突变，23名为LR突变）
54名ctDNAEGFR突变阳性患者中，平均的突变分子数为copies/reaction，平均丰度为5.15%。
血浆中EGFR敏感突变ddPCR定性及定量分析的预后意义
分别采用OS1和OS2两个参数进行预后的评估。OS1代表总生存期，OS2为EGFR-TKI治疗出现PD后至死亡的时间。
根据EGFR突变组织和血液检测的定性结果，将73名患者分为2组：组织和血液均为阳性患者54名，组织检测阳性/血液检测阴性患者19名。相比于血液检测阴性结果的患者，血液ctDNAEGFR突变检测阳性患者具有更好的PFS（median,12.6vs.6.7个月,P0.）和OS（median,35.6vs.23.8个月,P=0.）。具体结果见下图。
以EGFR突变的平均丰度5.15%为基准，根据EGFR突变的定量结果，将73名患者分为3组：EGFR突变丰度大于5.15%的高含量组、小于5.15%的低含量组和阴性组。相比于小于5.15%的低含量组患者，EGFR突变高含量组患者具有更好的PFS（median,15.4vs.11.1个月,P=0.）。具体结果见下面图表。
患者PD之后，其EGFR突变丰度与OS2之间没有相关性（median,17.2vs.16.6个月,P=0.）。
EGFR敏感突变的动态变化与预后的关系
对67名出现PD患者ctDNA中EGFR突变分析显示：在EGFR-TKI治疗过程中，29名（43.3%，29/67）患者血浆中的突变丰度呈下降趋势，13名（19.4%，13/67）患者则保持不变，25名（37.3%，25/67）患者呈上升趋势。
按照血浆中EGFR突变丰度的变化，将67名出现PD的患者分成2组：EGFR突变丰度下降组和非下降组。结果显示：在TKI治疗过程中，EGFR突变呈下降趋势患者具有更好的PFS（median,12.7vs.7.1个月,P=0.）和OS（median,28.3vs.14.9个月,P=0.）。具体结果见下图。
PD后血浆内EGFRTM的ddPCR检测
67名出现PD的患者中，有29名（43.3%）的ctDNA中检测出TM突变。患者ctDNA中TM的突变状态与预后之间不存在相关性。
进一步的分析显示：患者ctDNA中TM的突变状态与PD的模式无关（快速进展和缓慢进展,P=0.）。
PD后血浆ctDNA的NGS分析
样品：67名出现PD的患者中，选择12名患者。其中10名患者在TKI治疗前和出现PD后均采到血样，第25和29号患者在TKI过程中多次采血。总共有27份血样进行NSG分析。详细说明见下表。
NGS主要参数介绍：共针对个目标基因；平均测序深度X；软件自动识别的突变灵敏度为5%。
NGS结果之一：baseline的血浆ctDNA中，EGFR敏感突变是最主要的突变形式。其中3例为19Dels，8例为LR，另外1例为LV和HL突变。
NGS结果之二：baseline的血浆ctDNA中，并无EGFRTM的存在。出现PD后的血浆ctDNA中，6名（50%）患者为TM突变阳性。其中5名患者EGFR突变总体水平呈上升趋势。
NGS结果之三：除EGFR各种突变外，还发现了TP53（33.3%,4/12）、PTEN（16.7%,2/12）和MLL2（16.7%,2/12）基因的突变。具体结果见下图。
NGS结果之四：突变基因主要集中在DNA损伤检验点和TGF-β信号通路。示意图见下。此外，这些突变大多数在baseline和PD后的ctDNA内同时存在。
ddPCR和NGSctDNA分析的结果比较
两者的检测灵敏度方面，ddPCR的表现优于NGS，前者为0.04%，后者为5%。因此对于突变丰度低于5%的样品，NGS存在漏检的风险。针对上述12名患者血样的分析显示，NGS的灵敏度为89%，特异性为%。
总体上，ddPCR和NGS对ctDNA突变检测的结果具有很好的一致性（SpearmanCorrelation,R^2=0.,P0.）。具体结果见下图。
总结与讨论
由于肿瘤的异质性及在EGFR-TKIs治疗过程中肿瘤驱动基因的动态变化，对继发性耐药患者相关基因突变的动态定量分析显得越来越重要。
本研究的结论显示，对晚期肺腺癌患者EGFR突变的ddPCR分析能够实现高灵敏度的检测，灵敏度可达0.04%。
EGFR突变血液检测与组织检测的一致性为74%，可能的原因包括：接受TKI二线治疗及更后期治疗的患者占了50%（36/73），并且组织样品和血液样品的采集在时间上不同，组织样品一般在治疗前获取。另外对于晚期NSCLC患者，TKI治疗前的化疗会导致血浆内EGFR突变丰度的降低。
ddPCR对EGFR突变检测的分析显示：血浆ctDNA中EGFR敏感突变呈阳性的患者具有更好的PFS和OS；高丰度EGFR敏感突变（5.15%）患者具有更好的PFS；在TKIs治疗过程中，EGFR敏感突变丰度呈下降趋势的患者具有更好的PFS。对于明确的、已知的肿瘤基因突变，数字PCR是一种高灵敏度的分析手段。
本研究中采用的NGS方法能够发现晚期肺癌患者除了EGFR之外的肿瘤驱动基因及其突变，对于晚期患者的靶向治疗具有积极意义。
本研究属于回顾性研究，在此基础上已经计划展开多中心的clinicaltrails，即采用ddPCR对患者ctDNA中的EGFR突变进行检测，作为筛选接受EGFR-TKIs治疗患者的方法（BENEFIT,NCT）。
封面图片来自网络。
